実験原理 (シーケンシング / Ion PGM)

サンプル品質確認

Picogreenで濃度測定、ゲル電気泳動でサイズを確認します。

ライブラリーの製作

Multiplex PCR法によりターゲット領域を増幅し、アンプリコン中のプライマー配列を部分的に分解します。
その後、アンプリコンDNAにアダプターを付加します。

エマルジョンPCR

ライブラリDNAはアダプター配列を介してビーズにキャプチャーされます。ビーズを油中水滴エマルジョンの中に包み込み、 ビーズとライブラリDNA比1:1のマイクロリアクターを形成させます。その後、油中水滴エマルジョン内でのPCRにより、ライブラリDNAがビーズ上で数百万コピーまでクローナルに増幅されます。反応後、油中水滴エマルジョンを破壊し、ビーズを回収します。

シーケンシング

ビーズは半導体マイクロチップ上の微小なウェル(図B)に一つずつロードされます。シーケンシング過程では、dNTP(dTTP, dATP, dCTP, dGTP,)はウェルに順番に送液されます。テンプレート相補的なdNTPが添加されると、DNAポリメラーゼによる伸長反応によりdNTPがDNA鎖に取り込まれ、水素イオンが放出されます(図A)。このイオンの持つ電荷によって試薬のpHが変化し、これをイオンセンサーが検出します(図B)。このようにIon PGMでは化学情報を直接デジタル情報化することで塩基を読み取ります(図C)。

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