実験原理 (シーケンシング / 454 GS FLX)

454 GS FLXを用い、シーケンシングを行います。ランダムに断片化した所定の長さのDNAからライブラリを調製します。エマルジョンPCRにより、各ビーズ上にライブラリDNAをクローナルに増幅させた後、パイロシークエンス法により塩基配列を決定します。
サンプル品質確認

PicoGreenで濃度測定、電気泳動でサイズを確認します。

ライブラリーの作製

Fragment library
DNAを断片化後、両端にライブラリアダプターを付加します。

Mate paired end library
DNAを断片化します。末端にアダプターを付加した後、環状化します。その後、環状化DNAを切断し、アダプターを含む断片のみを精製した後、両端にライブラリアダプターを付加します。

エマルジョン PCR

ライブラリDNAはアダプターを介してビーズにキャプチャーされます。ビーズを油中水滴エマルジョンの中に包み込み、 ビーズとライブラリDNA比1:1のマイクロリアクターを形成させます。その後、油中水滴エマルジョン内でのPCRによりライブラリDNAがビーズ上で数百万コピーまでクローナルに増幅されます。反応後、油中水滴エマルジョンを破壊し、ビーズを回収します。

シーケンシング

ビーズはピコタイタープレートの各ウェルに一つずつロードされます。dNTPのうちのいずれか(dATP・dGTP・dCTP・dTTP)をウェル上に流します。テンプレート相補的なdNTPが添加されると、DNAポリメラーゼによる伸長反応によりdNTPがDNAに取りこまれ、ピロリン酸が放出されます。それを基質として、スルフリラーゼがATPを生成します。このATPとルシフェリンを基質として、ルシフェラーゼが発光反応を起こし、この発光シグナル強度をCCDカメラで検出します。発光の有無とシグナル強度から塩基配列を決定します。

PageTop

Copyright © 2017 RIKEN GENESIS CO.,LTD. All Rights Reserved.